垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

一、实验目的

学习

SDS-

聚丙烯酰胺凝胶电泳法

(SDS

—

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测定蛋白质的分子量的原理和

基本操作技术。

二、实验原理

蛋白质是两性电解质，在一定的

pH

条件下解离而带电荷。当溶液的

pH

大

于蛋白质的等电点

(pI)

时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液

的

pH

小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质

在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、

蛋白质颗粒的大小

和分子形状、电场强度等。

聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状

孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不

同孔径的两层凝胶；

这样，

当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，

受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小

的蛋白质分子在通过大孔胶时，

受到的阻滞基本相同，

因此以相同的速率移动；

当进入小孔胶时，

分子量大的蛋白质移动速度减慢，

因而在两层凝胶的界面处，

样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制

备上层胶

(

浓缩胶

)

和下层胶

(

分离胶

)

时，采用两种缓冲体系；上层胶

pH=6.7

—

6.8

，下层胶

pH

＝

8.9

；

Tris

—

HCI

缓冲液中的

Tris

用于维持溶液的电中性

及

pH

，是缓冲配对离子；

CI

-

是前导离子。在

pH6.8

时，缓冲液中的

Gly

-

为尾

随离子，而在

pH

＝

8.9

时，

Gly

的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间

pH

的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不

同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷

不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分

子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。

如

果

在

聚

丙

烯

酰

胺

凝

胶

中

加

入

一

定

浓

度

的

十

二

烷

基

硫

酸

钠

(SDS)

，

由

于

SDS

带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在

强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，

使蛋白质分子与

SDS

充分结合，形成带负电性的蛋白质—

SDS

复合物；此时，